A 39 esztendős quarterbacket 2004-ben a San Diego Chargers draftolta, ám rögtön elcserélte a New York Giantscel, mivel a legifjabb Manning fivér nem volt hajlandó játszani a Chargersben.
Manning az NFL-ben csak a New York-iak színeiben szerepelt, tizenhat idényben játszott. Összesen 236 alapszakasz- és tizenkét rájátszásmérkőzésen lépett pályára. A 42. (2008) és 46. (2012) Super Bowlon egyaránt győzelemre vezette csapatát – mindkétszer a New England Patriots ellen, s mindkét fináléban őt választották meg a döntő legértékesebb játékosának (MVP).
A 2019-es szezonban Eli Manning csak négy találkozón volt kezdő, a Giants szakvezetése inkább az újonc Daniel Jonesban bízott.
Pályafutása során az alapszakaszban több mint 57 ezer yardot és 366 touchdownt passzolt (244 interception mellett). Manning sérülés miatt sohasem hagyott ki meccset.
Az NFL-lel kapcsolatos hír, hogy január 22-i dátummal a Raiders hivatalosan is elköltözött Oaklandből és Las Vegas Raiders néven szerepel a továbbiakban.